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穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建

業(yè)務(wù)咨詢18392631026　　

外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)表達(dá)，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天；一類是穩(wěn)定表達(dá)（構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株），外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長(zhǎng)期表達(dá)目的基因。

　　建立穩(wěn)定細(xì)胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白、或穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。

篩選方法

慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
利用慢病毒整合表達(dá)特性來(lái)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，該方法克服了傳統(tǒng)質(zhì)粒挑單克隆方法周期久的弊端，可以在短時(shí)間內(nèi)高效獲取穩(wěn)定細(xì)胞株。

利用慢病毒制備穩(wěn)定株優(yōu)勢(shì)
（1）細(xì)胞適用種類廣泛，可用于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
（2）構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株時(shí)間短，表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；
（3）多種熒光標(biāo)記和抗性基因可選，滿足觀測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。

HUVEC

HepG2

穩(wěn)定細(xì)胞株分類

　　混合克隆穩(wěn)定細(xì)胞株

　　混合克隆細(xì)胞系是基因轉(zhuǎn)染后直接用抗藥篩選得到的，篩選出的細(xì)胞都表達(dá)抗性基因和目的基因，但包含了各種不同的細(xì)胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表達(dá)量均有所不同。

　　混合克隆細(xì)胞株篩選比較快速，費(fèi)用較低。在需要構(gòu)建的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率高，目的基因表達(dá)效率高的情況下，單克隆細(xì)胞株最后得到的表達(dá)效果和混合克隆細(xì)胞株并沒(méi)有顯著差異，這時(shí)多克隆細(xì)胞篩選是理想的選擇。

　　單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株

　　單克隆細(xì)胞系是由含有穩(wěn)定整合外源片段的單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增得到的細(xì)胞株，每個(gè)細(xì)胞的目的基因整合位置的表達(dá)量均高度一致，但可能丟失一些表型。單克隆細(xì)胞株篩選周期長(zhǎng)，費(fèi)用高。需要進(jìn)行細(xì)胞亞定位實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系，難感染的和表達(dá)率低的通常建議進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選。

服務(wù)流程

目的基因名稱，種屬等信息                細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)                    構(gòu)建好的穩(wěn)定株

載體需求（抗性、熒光、便簽等）         質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)檢測(cè)               穩(wěn)定株構(gòu)建說(shuō)明書(shū)

目的細(xì)胞等信息                         慢病毒包裝與純化               穩(wěn)定株篩選及鑒定

其它特殊需求                          穩(wěn)定株篩選及鑒定                構(gòu)建的質(zhì)粒，病毒等

已構(gòu)建的穩(wěn)定株列表（部分）

中文名稱	對(duì)應(yīng)穩(wěn)定株	對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件	細(xì)胞來(lái)源
人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤	U-87 MG-luc-mNeonGreen-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人膠質(zhì)瘤細(xì)胞	U251-CMV-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞	T24-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人胰腺癌細(xì)胞系	SW 1990-EGFP-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞	SK-N-SH-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+0.4ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細(xì)胞	SK-BR-3-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人子宮頸鱗癌細(xì)胞	SiHa-CMV-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞	Neuro-2a-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞	Neuro-2a-CMV-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細(xì)胞	MDA-MB-468-EGFP-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細(xì)胞	MDA-MB-231-CMV-EGFP-Luc-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細(xì)胞	MCF7-CMV-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠肺癌細(xì)胞	LLC-CMV-sfGFP-Luc-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人慢性髓原白血病細(xì)胞	K-562-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞	Jurkat-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+0.5ug/ml Puromycin	中科院
人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞	ishikawa-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細(xì)胞	HuH-7-CMV-sfGFP-Luc-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細(xì)胞	HuH-7-Luc Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細(xì)胞	HT-29-EGFP-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細(xì)胞	Hep G2-CMV-EGFP-Luc-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細(xì)胞	Hep G2-CMV-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人宮頸癌細(xì)胞	HeLa-EGFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人宮頸癌細(xì)胞	HeLa-RFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細(xì)胞	HCT 116-CMV-EGFP-Luc-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人咽鱗癌細(xì)胞	FaDu-CMV-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞	CT26.WT-CMV-Luc-Puro	RPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin	中科院
小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞	CT26.WT-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin	中科院
人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞	Caki-1-EGFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞	BHK-21 [C-13]-CMV-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞	B-CPAP-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1%NEAA+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠黑色素瘤細(xì)胞	B16-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠黑色素瘤細(xì)胞	B16-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞	A549-CMV-EGFP-Puro	F12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞	A549-luc-mNeonGreen-Puro	F12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠乳腺癌細(xì)胞	4T1-CMV-Luc-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠乳腺癌細(xì)胞	4T1-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
人胃癌細(xì)胞	MKN-45-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	RPMI-1640+20%FBS+2ug/ml Puromycin	協(xié)和
人肺腺癌細(xì)胞	NCI-H1975-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細(xì)胞	HCT116-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院

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