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腺相關病毒AAV
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腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成員之一，是一類無法自主復制、無被膜的二十面體微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。研究中采用的重組腺相關病毒載體（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的基因載體，由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣（對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力）、擴散能力強、體內表達基因時間長等，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
AAV基因組結構
rAAV包裝純化及滴度檢測
AAV包裝過程中，包裝質粒負責編碼目的基因以及兩個末端反向重復序列（ITR，對于病毒的復制和包裝具有決定性作用），輔助質粒包含AAV包裝所需的cap（編碼病毒衣殼蛋白）和rep（參與病毒的復制）基因，以及腺病毒Helper質粒。三種質粒共同轉染293T細胞后，AAV病毒開始復制和包裝。煊晟興成生物腺相關病毒的生產和質控采取了國際學術界公認的標準流程，采用三質粒系統在293T細胞中進行包裝。所獲得的病毒顆粒經過超速離心純化，并通過qPCR對病毒基因拷貝進行滴定。另外，我們也可以根據使用者要求，提供蛋白染色檢測衣殼蛋白的完整性以及內毒素含量等。一般情況下rAAV的滴度在1012~1013 VG/ml，完全可以滿足各類整體實驗的使用要求。
AAV包裝流程圖
滴度檢測方法：定量PCR檢測病毒基因組中外源DNA拷貝數。
滴度檢測原理：腺相關病毒的基因組為單鏈DNA，外源DNA拷貝數代表病毒基因組拷貝數。
rAAV侵染細胞過程
煊晟興成生物純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細胞，侵染細胞時，AAV與細胞表面特異性受體結合，激活胞內信號通路，進而觸發AAV通過受體介導的內吞作用進入細胞，在核內體、高爾基體等細胞器的協助下進入細胞核，隨后病毒裂解，其單鏈DNA需復制成為雙鏈DNA后表達目的基因。
rAAV作用機制
rAAV載體優勢
1、安全性高、免疫原性低：AAV是一種復制缺陷型DNA病毒，無自主復制能力，野生型AAV依賴rep基因進行低頻定點整合，rAAV不整合。目前尚無由AAV引起的人類及哺乳動物疾病報道，也是FDA批準上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一。
2、宿主細胞范圍廣：AAV具有廣泛的宿主范圍，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。
3、擴散能力強：AAV直徑約20-26nm，體積小，滴度高，具有良好的擴散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血腦屏障的能力，在神經科學領域應用廣泛。
4、體內表達基因時間長：AAV具有保持長期基因轉錄表達能力，體內表達一般3周可以達到高峰，隨后持續高表達，作用時間＞5個月。
5、種類多樣：AAV血清型眾多，此外，根據不同的實驗設計，我們還在不斷的突變，篩選新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。
不同病毒的生物學特性比較
基于上述特點，AAV被視為是一種高效和安全的體外及體內基因轉導工具。尤其在整體水平研究中，與其他常用病毒工具載體相比，AAV具有感染過程溫和長效的表達能力，是基因操作的利器。
rAAV血清型選擇
目前已注冊的AAV種類總數已超過196種，靈長類動物體內有13種不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最為徹底、應用最為廣泛的病毒載體。隨著研究的不斷深入，研究人員發現不同血清型的AAV之間可以雜交，而雜交后的AAV會兼有雜合雙方的特點，因此，AAV亞型順勢誕生。
現在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結合產生的混合體病毒載體，一般標記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩定表達和基因整合能力，同時獲得了不同血清型的組織感染嗜親性（不同血清型衣殼表面的特定結構位點決定了各自受體的特異性），表現出一定的器官靶向特異性。
不同血清型AAV的組織嗜親性
血清型 | 組織親和性 |
rAAV2/1 | 神經系統（高滴度順向跨突觸），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌 |
rAAV2/2 | 視網膜、神經系統，肌肉，肝臟，血管平滑肌 |
rAAV2/3 | 肌肉，肝臟，肺，眼 |
rAAV2/4 | 神經系統，肌肉，眼，腦 |
rAAV2/5 | 神經系統，肺，視網膜，肝臟，滑膜關節 |
rAAV2/6 | 神經系統，肺，肌肉，心臟 |
rAAV2/7 | 肌肉，肝臟 |
rAAV2/8 | 神經系統，肝臟，肌肉，脂肪組織，胰腺，視網膜， |
rAAV2/9 | 神經系統，心肌，肺，視網膜，皮膚 |
rAAV2-retro | 神經系統（逆向非跨突觸） |
AAV-PHP.eB | 跨血腦屏障（靜脈注射） |
AAV-PHP.S | 全外周神經（尾靜脈注射） |
AAV-PAN | 胰腺（腹腔注射） |
AAV-LUNG | 肺（尾靜脈注射） |
AAV-DJ | 視網膜，肺，腎臟，體外感染細胞 |
AAV-7m8 | 視網膜 |
AAV-ShH10Y | 視網膜Muller細胞 |
AAV-Rh10 | 肝臟，血液，心臟，體外感染細胞 |
AAV-Anc80L65 | 內耳、視網膜、骨骼肌、肝臟 |
AAV-SCH9 | SVZ區神經干細胞 |
小建議：如您不確定選擇哪種血清型，可嘗試使用Pandora’s Virus （AAV多種血清型）進行預實驗，通過比較不同血清型對目標組織的感染效果，摸索最佳實驗條件（注射方法、注射位點、病毒用量等），以便得到更理想的實驗結果。
Pandora’s Virus 詳情：
rAAV載體應用案例
1、在神經科學領域中的應用
1.1 外側韁核&光遺傳學
[腺相關病毒, 抑郁癥, 光遺傳]
注射部位：小鼠LHb
載體：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29E+12 VG/mL
注射體積：100nl
觀察時間：1個月
1.2 臂旁核&化學遺傳學
[腺相關病毒, 癢, 光遺傳,化學遺傳]
注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1E+13 VG/mL
注射體積：150nl
觀察時間：3周
1.3 丘腦&鈣離子成像
[腺相關病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射體積：100nl
觀察時間：4周
1.4 丘腦室旁核&殺死神經元
[腺相關病毒, 覺醒]
注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射體積：兩支病毒1:1混合注射100nl
觀察時間：4周
1.5 海馬、皮層&逆向非跨突觸（rAAV2/retro）
[腺相關病毒, 焦慮癥, 光遺傳]
注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射體積：300nl
觀察時間：4周
1.6 初級運動皮層&順向跨突觸（rAAV2/1）
[腺相關病毒, 神經環路]
注射部位：小鼠皮層M1、PMC
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5E+12 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2E+13 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：1E+12 VG/mL
注射體積：多點注射，每位點30-40nl
觀察時間：4周
1.7 邊緣前皮質&跨突觸示蹤（WGA-Cre）
[腺相關病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]
注射部位：小鼠PrL
載體：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度：4.28E+12 VG/mL
注射體積：300nl
觀察時間：4周
1.8 皮層&AAV干擾（AAV-shRNA）
[腺相關病毒, 抑郁癥]
注射部位：小鼠mPFC
載體：AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
病毒滴度：3E+12 VG/mL
注射體積：1.5ul
觀察時間：2周
1.9稀疏標記
載體信息：pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre（108-109VG/mL）、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE（1012VG/mL）
rAAV2/8尾靜脈注射感染肝臟實例
病毒總量：1E+11VG
注射體積：200ul
病毒表達時間：四周
2..0 rAAV感染肺部
[腺相關病毒, 干擾]
注射方式：氣管注射
感染部位：肺部
載體：pAAV-Tgfb1 shRNA
血清型：rAAV2/9
病毒注射量：1E+11 VG（50ul）
觀察時間：3周